Tor Vergata
Alla fine degli anni ’50 William Russell e Rex Burch elaborarono il principio delle 3R (Replacement, Reduction, Refinement) quale linea guida essenziale per l’impiego corretto degli animali da laboratorio. Questo concetto ha influenzato profondamente lo sviluppo delle scienze degli animali da laboratorio e le relative regolamentazioni legislative introdotte da diversi paesi negli ultimi decenni. In Europa, in particolare, tutti i paesi membri della UE hanno dovuto recepire le disposizioni della direttiva 86/609/CEE concernente la protezione degli animali utilizzati a fini sperimentali o ad altri fini scientifici. La direttiva, che prevede la partecipazione attiva della Commissione europea e degli Stati membri allo sviluppo, alla convalida e all'accettazione di metodi intesi a ridurre, perfezionare o sostituire l'uso di animali da laboratorio, stabilisce: "Si eviterà di eseguire un esperimento qualora per ottenere il risultato ricercato sia ragionevolmente e praticamente applicabile un altro metodo, scientificamente valido, che non implichi l'impiego di animali". In questo ambito si inserisce e si giustifica il concetto di metodi alternativi alla sperimentazione animale; tali sono considerate quelle procedure che conducono alla sostituzione di un esperimento sull’animale, o alla riduzione del numero di animali richiesti, o all’ottimizzazione delle tecniche al fine di limitare la sofferenza dell’animale.
All’interno della CIMETA sono presenti le competenze, le strutture e le attrezzature necessarie a utilizzare ed eventualmente sviluppare alcune tecniche alternative alla sperimentazione animale, in particolare, tecniche in vitro, tecniche immunologiche e tecniche di biologia molecolare.
Le tecniche in vitro in nostro possesso sono quelle rappresentate
da colture cellulari continue e primarie. Nel primo caso vengono usate linee
cellulari stabilizzate di origine umana o animale, con diversa derivazione
istologica. Le linee primarie usate per eseguire studi in vitro sono invece
principalmente rappresentate da cellule del sistema immunitario presenti nel
sangue periferico sia umano che animale. Con queste colture è possibile eseguire
una serie di screening per valutare l’attività biologica, inclusa la tossicità,
di composti xenobiotici (1), quali:
• il saggio di esclusione del trypan blue (2);
• il saggio di proliferazione con MTT (3-(4,5-dimetiltiazol-2-yl)-2,5-difeniltetrazolio
bromide) (3).
Diverse metodologie prevedono l’analisi citofluorimetrica delle linee cellulari
coltivate, dopo marcatura con sonde fluorescenti, per studiare in particolare,
• il ciclo cellulare tramite marcatura con ioduro di propidio (4);
• la necrosi/apoptosi cellulare dopo marcatura con ioduro di propidio e annessina
V (5);
• la proliferazione cellulare tramite marcatura con la sonda fluorescente
CFSE (6);
• il fenotipo cellulare tramite marcatura con anticorpi monoclonali coniugati
a fluorocromi diretti contro specifiche molecole di membrana (7);
• l’attività citotossica linfocitaria quando gli anticorpi sono diretti contro
molecole effettrici come perforina e granzima (8);
• la produzione di citochine e chemochine tramite marcatura intra-citoplasmatica
delle cellule con anticorpi fluorescenti specifici per queste molecole (9);
• la produzione di citochine e chemochine tramite marcatura dei sopranatanti
di coltura con biglie fluorescenti (10).
L’identificazione e misurazione di citochine provenienti
da colture cellulari viene anche determinata, alla STA, con le seguenti tecniche
(11):
• ELISA
• ELISPOT
• PCR quantitativa
In aggiunta alle metodiche elencate sopra, presso la CIMETA è possibile produrre anticorpi monoclonali in vitro, a partire dall’iniziale immunizzazione degli animali e la selezione di ibridomi da coltivare in terreni sintetici, in sostituzione dell’inoculo intraperitoneale in topi per l’induzione di ascite contenente gli anticorpi monoclonali.
Altri metodi alternativi alla sperimentazione animale basati
sull’uso di tecniche di biologia molecolare come la PCR, applicati alla CIMETA
per la ricerca di patogeni microbici negli alimenti, riguardano, in particolare:
• l’identificazione della contaminazione da Brucella, precedentemente eseguita
con l’infezione sperimentale della cavia (12);
• la caratterizzazione della tossina botulinica, alternativa al mouse neutralization
test, un biosaggio che consiste nell’iniettare estratti di un alimento infettato,
neutralizzati e non con antitotossine specifiche, in animali da laboratorio
per rilevarne i sintomi (13);
• l’identificazione dei ceppi di Escherichia coli VTEC (14).
Un modo ulteriore per ridurre il numero di animali utilizzati per ricavare una determinata informazione consiste nell’applicare una analisi statistica appropriata al disegno sperimentale; a questo riguardo è operativa una collaborazione tra il Centro di Servizi Interdipartimentale Stazione per la Tecnologia Animale e il Centro Interdipartimentale di Biostatistica e Bioinformatica dell'Università degli Studi di Roma "Tor Vergata" al fine di garantire una pianificazione statistica degli esperimenti in relazione alla diminuzione degli animali da utilizzare come previsto dalla normativa vigente sulla sperimentazione animale.
Tra i servizi presenti alla CIMETA è operativo quello di bioimaging,
che si avvale dello strumento “Kodak Image Station In Vivo Fx”. Questa apparecchiatura,
tramite la co-registrazione di segnali ottici (luce bianca, fluorescenza,
luminescenza) con immagini a raggi X e/o con radioisotopi, permette di analizzare
immagini “in vivo”, ad alta risoluzione, in piccoli modelli animali (topi
e ratti). Ciò rende possibile lo studio di processi patologici a livello molecolare
in animali vivi, consentendo, inoltre di seguirne la progressione nel tempo
negli stessi animali, evitando quindi di sacrificare periodicamente gli animali.
Questa tecnologia consente di ridurre il numero di animali usati nella sperimentazione,
permettendo l’applicazione del principio di Reduction enunciato da Russell
e Burch (15).
References
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