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Metodologie alternative alla sperimentazione animale

Alla fine degli anni ’50 William Russell e Rex Burch elaborarono il principio delle 3R (Replacement, Reduction, Refinement) quale linea guida essenziale per l’impiego corretto degli animali da laboratorio. Questo concetto ha influenzato profondamente lo sviluppo delle scienze degli animali da laboratorio e le relative regolamentazioni legislative introdotte da diversi paesi negli ultimi decenni. In Europa, in particolare, tutti i paesi membri della UE hanno dovuto recepire le disposizioni della direttiva 86/609/CEE concernente la protezione degli animali utilizzati a fini sperimentali o ad altri fini scientifici. La direttiva, che prevede la partecipazione attiva della Commissione europea e degli Stati membri allo sviluppo, alla convalida e all'accettazione di metodi intesi a ridurre, perfezionare o sostituire l'uso di animali da laboratorio, stabilisce: "Si eviterà di eseguire un esperimento qualora per ottenere il risultato ricercato sia ragionevolmente e praticamente applicabile un altro metodo, scientificamente valido, che non implichi l'impiego di animali". In questo ambito si inserisce e si giustifica il concetto di metodi alternativi alla sperimentazione animale; tali sono considerate quelle procedure che conducono alla sostituzione di un esperimento sull’animale, o alla riduzione del numero di animali richiesti, o all’ottimizzazione delle tecniche al fine di limitare la sofferenza dell’animale.

All’interno della STA sono presenti le competenze, le strutture e le attrezzature necessarie a utilizzare ed eventualmente sviluppare alcune tecniche alternative alla sperimentazione animale, in particolare, tecniche in vitro, tecniche immunologiche e tecniche di biologia molecolare.

Le tecniche in vitro in nostro possesso sono quelle rappresentate da colture cellulari continue e primarie. Nel primo caso vengono usate linee cellulari stabilizzate di origine umana o animale, con diversa derivazione istologica. Le linee primarie usate per eseguire studi in vitro sono invece principalmente rappresentate da cellule del sistema immunitario presenti nel sangue periferico sia umano che animale. Con queste colture è possibile eseguire una serie di screening per valutare l’attività biologica, inclusa la tossicità, di composti xenobiotici (1), quali:
• il saggio di esclusione del trypan blue (2);
• il saggio di proliferazione con MTT (3-(4,5-dimetiltiazol-2-yl)-2,5-difeniltetrazolio bromide) (3).
Diverse metodologie prevedono l’analisi citofluorimetrica delle linee cellulari coltivate, dopo marcatura con sonde fluorescenti, per studiare in particolare,
• il ciclo cellulare tramite marcatura con ioduro di propidio (4);
• la necrosi/apoptosi cellulare dopo marcatura con ioduro di propidio e annessina V (5);
• la proliferazione cellulare tramite marcatura con la sonda fluorescente CFSE (6);
• il fenotipo cellulare tramite marcatura con anticorpi monoclonali coniugati a fluorocromi diretti contro specifiche molecole di membrana (7);
• l’attività citotossica linfocitaria quando gli anticorpi sono diretti contro molecole effettrici come perforina e granzima (8);
• la produzione di citochine e chemochine tramite marcatura intra-citoplasmatica delle cellule con anticorpi fluorescenti specifici per queste molecole (9);
• la produzione di citochine e chemochine tramite marcatura dei sopranatanti di coltura con biglie fluorescenti (10).

L’identificazione e misurazione di citochine provenienti da colture cellulari viene anche determinata, alla STA, con le seguenti tecniche (11):
• ELISA
• ELISPOT
• PCR quantitativa

In aggiunta alle metodiche elencate sopra, presso la STA è possibile produrre anticorpi monoclonali in vitro, a partire dall’iniziale immunizzazione degli animali e la selezione di ibridomi da coltivare in terreni sintetici, in sostituzione dell’inoculo intraperitoneale in topi per l’induzione di ascite contenente gli anticorpi monoclonali.

Altri metodi alternativi alla sperimentazione animale basati sull’uso di tecniche di biologia molecolare come la PCR, applicati alla STA per la ricerca di patogeni microbici negli alimenti, riguardano, in particolare:
• l’identificazione della contaminazione da Brucella, precedentemente eseguita con l’infezione sperimentale della cavia (12);
• la caratterizzazione della tossina botulinica, alternativa al mouse neutralization test, un biosaggio che consiste nell’iniettare estratti di un alimento infettato, neutralizzati e non con antitotossine specifiche, in animali da laboratorio per rilevarne i sintomi (13);
• l’identificazione dei ceppi di Escherichia coli VTEC (14).

Un modo ulteriore per ridurre il numero di animali utilizzati per ricavare una determinata informazione consiste nell’applicare una analisi statistica appropriata al disegno sperimentale; a questo riguardo è operativa una collaborazione tra il Centro di Servizi Interdipartimentale Stazione per la Tecnologia Animale e il Centro Interdipartimentale di Biostatistica e Bioinformatica dell'Università degli Studi di Roma "Tor Vergata" al fine di garantire una pianificazione statistica degli esperimenti in relazione alla diminuzione degli animali da utilizzare come previsto dalla normativa vigente sulla sperimentazione animale.

Tra i servizi presenti alla STA è operativo quello di bioimaging, che si avvale dello strumento “Kodak Image Station In Vivo Fx”. Questa apparecchiatura, tramite la co-registrazione di segnali ottici (luce bianca, fluorescenza, luminescenza) con immagini a raggi X e/o con radioisotopi, permette di analizzare immagini “in vivo”, ad alta risoluzione, in piccoli modelli animali (topi e ratti). Ciò rende possibile lo studio di processi patologici a livello molecolare in animali vivi, consentendo, inoltre di seguirne la progressione nel tempo negli stessi animali, evitando quindi di sacrificare periodicamente gli animali. Questa tecnologia consente di ridurre il numero di animali usati nella sperimentazione, permettendo l’applicazione del principio di Reduction enunciato da Russell e Burch (15).

 

References

1 - Gennari A, Ban M, Braun A, Casati S, Corsini E, Dastych J, Descotes J, Hartung T, Hooghe-Peters R, House R, Pallardy M, Pieters R, Reid L, Tryphonas H, Tschirhart E, Tuschl H, Vandebriel R, Gribaldo L. The use of in vitro systems for evaluating immunotoxicity: the report and recommendations of an ECVAM workshop. J Immunotoxicol. 2005, 2 (2): 61-83.

2 - Witeska M, and Wakulska M. The Effects of heavy metals on common carp white blood cells in vitro. Altern Lab Anim. 2007, 35 (1): 87-92.

3 - Alesiani D, Pichichero E, Canuti L, Cicconi R, Karou D, D’Arcangelo G and Canini A. Identification of phenolic compounds from medicinal and melliferous plants and their cytotoxic activity in cancer cells. Caryologia. 2007, 60 (1): 90-95

4 - Alesiani D, Cicconi R, Mattei M, Montesano C, Bei R, Canini A. Cell cycle arrest and differentiation induction by 5,7-dimethoxycoumarin in melanoma cell lines. Int J Oncol. 2008, 32 (2): 425-34.

5 - Pallardy M, Biola A, Lebrec H, Bréard. Assessment of apoptosis in xenobiotic-induced immunotoxicity. Methods. 1999, 19 (1): 36-47.

6 - Bimczok D, Rau H, Sewekow E, Janczyk P, Souffrant WB, Rothkötter HJ. Influence of carvacrol on proliferation and survival of porcine lymphocytes and intestinal epithelial cells in vitro. Toxicol In Vitro. 2008, 22 (3): 652-8.

7 - Hertz-Picciotto I, Dostal M, Dejmek J, Selevan S G, Wegienka G, Gomez-Caminero A, and Sram R J. Air pollution and distributions of lymphocyte immunophenotypes in cord and maternal blood at delivery. Epidemiology. 2002, 13: 172–183.

8 - Li Q, Nakadai A, Matsushima H, Miyazaki Y, Krensky AM, Kawada T, Morimoto K. Phytoncides (wood essential oils) induce human natural killer cell activity. Immunopharmacol Immunotoxicol. 2006, 28 (2): 319-33.

9 - Godoy-Ramirez K, Franck K, Mahdavifar S, Andersson L, Gaines H. Optimun culture conditions for specific and non-specific activation of whole blood and PBMC for intracellular cytokine assessment by flow cytometry. J Immunol Methods. 2004, 292: 1-15.

10 - Morgan E, Varro R, Sepulveda H, Ember JA, Apgar J, Wilson J, Lowe L, Chen R, Shivraj L, Agadir A, Campos R, Ernst D, Gaur A. Cytometric bead array: a multiplexed assay platform with applications in various areas of biology. Clin Immunol. 2004,110,(3):,252-66.

11 - House RV. Cytokine measurement techniques for assessing hypersensitivity. Toxicology. 2001, 158 (1-2): 51-8.

12 - Brenner DJ, Garrity GM, Krieg NR, Staley JT. Bergey’s manual of systematic bacteriology, second edition, volume two: The proteobacteria, Parts A-C. © 2005 Springer – Verlag.

13 - Lindström M, Korkeala H. Laboratory diagnostics of botulism. Clin Microbiol Rev. 2006, 19 (2): 298-314.

14 - Nielsen EM, Andersen MT. Detection and characterization of verocytotoxin-producing Escherichia coli by automated 5' nuclease PCR assay. J Clin Microbiol. 2003, 41 (7): 2884-93.

15 - Davis MA. Introduction: Bioimaging of Laboratory Animals: The Visual Translation of Molecular Insights. ILAR Journal. 2008, 49 (1): 1-3.

 

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